L'histoire se déroule en l'an 1191, lors de la Troisième croisade dans l'esprit de l' Ordre du Temple. Le joueur dirige un certain Altaïr. « Al-taïr » vient de l'arabe et signifie « l'aigle », le personnage agissant comme un oiseau de proie pendant les assassinats. Ce jeune homme désapprouve les décisions des hautes autorités ecclésiastiques usant un peu trop souvent de la potence.
Altaïr était un Maître Assassin jusqu'au moment où il échoua dans une mission. La Guilde des Assassins le rétrograda au rang des Initiés, le plus bas. Altaïr devra donc accomplir de nouvelles missions pour retrouver son rang et honneur. Comme le titre du jeu l'indique, cet Altaïr est un assassin agissant en représailles de ces exécutions arbitraires. Le mot « assassin » n'est donc ici pas du tout péjoratif pour ce personnage.
Le scénario est l'histoire de l'ancêtre de Desmond Miles, un autre personnage du jeu vidéo mais vivant au XXIe siècle, jeune homme capturé par absterego, une organisation qui veut mettre la main sur un puissant artefact. Dans l'histoire, le joueur peut donc incarner tour à tour Desmond et Altaïr, Desmond s'allongeant sur une machine appelé « animus » lui permettant de revivre les souvenirs de son ancêtre. S'ensuit une série de 9 assassinats visant les hauts membres des Croisés et des Sarasins.
Le paragraphe suivant décrit la fin du jeu :
À la fin de cette série, Altaïr se rend compte qu'il est victime d'une machination et tue son maître Al-mualim (nom qui vient de l'arabe et signifie « le savant » ou « le sage ») qui en est l'auteur. De retour dans le présent Desmond Miles est lui aussi conscient de ce complot et des expériences qui ont été faites sur lui. Le jeu se termine par une vision d'aigle ou il perçoit d'étranges signes sur le mur de sa chambre, signes de croyances diverses et vestiges de la personne séquestrée avant lui. Mais l'histoire n'est pas finie puisque "Assassin's Creed" s'avère être une trilogie.